DB43∕T 1370-2017 葫芦科蔬菜小西葫芦黄花叶病毒检测技术规程.pdf

湖南省地方标准DB43DB43/T 13702017 湖南省质量技术监督局发 布2017-12-31 发布2018-03-31 实施ICS 65.020B 16葫芦科蔬菜小西葫芦黄花叶病毒检测技术规程Technical Regulation for Detection of Zucchini Yellow Mosaic Virus in Cucurbitaceae Vegetables湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 I 目 次 前言 1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 仪器和耗材15 检测方法26 检测结果判定2附录 A （规范性附录） 反转录-聚合酶链式反应 （RT-PCR） 检测方法3附录 B （规范性附录） 反转录-实时荧光定量 PCR （RT-qPCR） 检测方法6 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省植物保护研究所提出。 本标准由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：湖南省植物保护研究所。 本标准主要起草人：孙书娥、朱春晖、刘勇、张德咏、刘骏、张松柏、谭新球、张卓、陈远超。 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 1 葫芦科蔬菜小西葫芦黄花叶病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了葫芦科蔬菜小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）检测技术规程的规范性引用文件、术语和定义、仪器和耗材、检测方法、检测结果判定。 本标准适用于葫芦科蔬菜作物小西葫芦黄花叶病毒的检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 小西葫芦黄花叶病毒 Zucchini Yellow Mosaic Virus，ZYMV ZYMV 是马铃薯 Y 病毒属的重要成员，病毒粒体长丝状。 3.2 反转录-聚合酶链式反应 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR 在反转录酶作用下将 mRNA 反转录成 cDNA，再利用 PCR 以 cDNA 为模板，扩增合成目的片段的方法。 3.3 反转录-实时荧光定量PCR检测法 Reverse Transcriptase-Quantitative Real-time PCR， RT-qPCR 先利用反转录酶将 RNA 反转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板，然后在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 3.4 阳性对照 Positive Control 凡是确定可以出现预期结果的处理，称为阳性对照。 3.5 阴性对照 Negative Control 凡是确定不会出现预期结果的处理，称为阴性对照。 3.6 空白对照 Blank Control 凡是不加处理因素的处理，称为空白对照。 4 仪器和耗材 台式离心机、水浴锅、制冰机、超净工作台、PCR 仪、qPCR 仪、冰箱、灭菌锅、电子天平、微波炉、 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 2水平电泳槽、凝胶成像系统、移液器、枪头、离心管、研钵、研棒、一次性 PE 手套、PCR 管等。 5 检测方法 在以下的两种方法中，均需设置阳性对照、阴性对照和空白对照。 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法见附录 A。 反转录-实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测方法见附录 B。 6 检测结果判定 根据附录 A 判定检测结果。检测结果为阳性，即判定该样品含有 ZYMV；检测结果为阴性，则判定该样品不含有 ZYMV。 根据附录 B 判定检测结果。检测结果为阳性，即判定该样品含有 ZYMV；检测结果为阴性，则判定该样品不含有 ZYMV。 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 3 附录 A （规范性附录） 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法 1 试剂和缓冲液 除非另有说明，本标准中仅使用确认的分析纯试剂，在本标准中所使用水按 GB 6682 执行。 1.1 RNA 提取试剂 1.1.1 GB 缓冲液 异硫酸氢胍 4.0 mol/L NaAc(pH5.2) 0.2 mol/L EDTA(pH8.0) 25 mmol/L KAc 1.0 mol/L PVP-40 2.5%(W/V) 高压灭菌后 4保存。 1.1.2 WB 缓冲液 EDTA(pH8.0) 1 mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 20 mmol/L NaCl 10 mmol/L 高压灭菌后，4保存。使用时按 1:1 比例用无水乙醇稀释。 1.1.3 10% NLS 溶液 将 1 g 月桂酰基肌氨酸钠（NLS）溶于 10 mL 水中即得 10% NLS 溶液。 1.1.4 NaI 溶液 NaI 6 mol/L Na2SO3 0.15 mol/L 用棕色试剂瓶装，高压灭菌后，4保存。 1.1.5 硅溶液 将 60 g 二氧化硅溶于 500 mL 水中，静置 24 h，倒掉 470 mL 上清，再加水至 500 mL，静置 5 h，倒掉 440 mL 上清，用 HCl 将剩下的 60 mL 沉淀调 pH 值至 2.0，高压灭菌后，200 L/管分装，-20保存。 1.2 RT-PCR 试剂 反转录酶，Taq DNA 聚合酶，dNTPs（2.5 mM） 1.3 50TAE 电泳缓冲液 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 4Tris 242 g Na2EDTA2H2O 37.2 g 加约 800 mL 去离子水，充分搅拌均匀，加入冰醋酸 57.1 mL，加水定容至 1000 mL。使用时按 1:50用无菌水稀释成 1TAE 电泳缓冲液。 1.4 琼脂糖凝胶配制 取琼脂糖按 1:100（g : mL）加入 1TAE 电泳缓冲液，用微波炉加热至完全溶解，轻轻倒入已插好梳子的电泳槽胶板内，待完全冷却凝固后，拔掉梳子，备用。 1.5 其它试剂 无水乙醇、Loading Buffer、SYBR Green I 染色液。 2 检测引物 上游引物 ZYMV-F：TGCTCAAGGCCGGAACTGT 下游引物 ZYMV-R：GCTTCAATCGCACGGTTACAC 预期扩增大小为 621 bp。 3 样品总 RNA 提取 取病叶 0.1 g，加 1 mL GB 溶液，研磨至匀浆；取 500 L 研磨液，加 100 L NLS，70温育 10 min，不时上下颠倒混匀，冰上放置 5 min，13000 rpm 离心 10 min；取 300 L 上清，加 150 L 无水乙醇，300 L NaI，25 L 硅溶液，混匀，室温下不停颠倒混匀 10 min；6000 rpm 离心 1 min，倒去上清；加 500 L WB 溶液洗涤，6000 rpm 离心 1 min，倒掉上清；重复 6000 rpm 离心一次；沉淀加ddH2O 150 L，70温育 4 min，当温育 1 min 时将离心管盖打开，随即盖上；13000 rpm 离心 3 min，取 130 L 上清即为样品总 RNA，-20冰箱保存备用。或采用其它 RNA 提取试剂盒，操作步骤参照说明书。 阳性样品为已鉴定被 ZYMV 侵染的植物材料， 阴性样品为健康的同种植物材料， 空白对照为无菌水，阳性样品和阴性样品按同样方法制备和保存。 4 RT-PCR 检测 4.1 反转录合成 cDNA 反应体系为 20 L，在 PCR 管中加入以下试剂： 待测样品总RNA 8 L 2反应缓冲液 10 L 10 mol/L下游引物ZYMV-R 1 L 反转录酶 1 L 轻轻混匀后，25反应 10 min 后，再 42反应 30 min，85反应 5 min 后终止反应，即得 cDNA。不同生产厂家的反转录试剂盒操作步骤应参照相应产品的说明书进行。 4.2 PCR 扩增 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 5 反应体系为 20 L，在 PCR 管中加入以下试剂： 上述合成的cDNA模板 1 L 10PCR缓冲液 2 L 2.5 mmol/L dNTPs 1.6 L 10 mol/L上游引物ZYMV-F 1 L 10 mol/L下游引物ZYMV-R 1 L Taq DNA聚合酶 ddH2O 0.3 L 13.1 L 反应步骤程序： a 预变性 94 2 min b 变性 94 30 s c 退火 56 30 s d 延伸 72 1 min 步骤 b-d 35 个循环后，72延伸 10 min，4终止反应，扩增产物 4冰箱保存备用。 5 扩增产物检测 将 5 L PCR 扩增产物、2 L Loading Buffer 和 3 L SYBR Green I 染色液混合，加入制作好的琼脂糖凝胶点样孔内，其中一个点样孔加入 DNA 分子量标记。100 V 电泳 30 min 左右。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像系统中，根据 DNA 分子量标记判断扩增出的目的条带大小，观察并记录DNA 条带有无和条带大小。 6 结果记录 见图 A1。 图 A1 西葫芦上 ZYMV 的 RT-PCR 检测 (MARK:DL2000，CK1:空白对照，CK2：阴性对照，1：阳性对照，27 阳性样品) 7 结果判断 RT-PCR 扩增产物大小为 621bp。 阳性对照有目标条带而阴性对照和空白对照无目标条带时， 检测结果有效。待测样品在 620 bp 左右出现核酸条带，表明样品为阳性，无目标条带则为阴性。 2000 bp 1000 bp 750 bp 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 6 附录 B （规范性附录） 反转录-实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测方法 1 试剂和缓冲液 除非另有说明，在本标准中所使用水按 GB 6682 执行。 1.1 RNA 提取试剂 同附录 A 的 1.1。 2 检测引物 上游引物 qZYMV F：GTACCTGCACTGGATCTGC 下游引物 qZYMV R：GCTTCAATCGCACGGTTACAC 预期扩增大小为 193 bp。 3 样品总 RNA 提取 方法同附录 A 的 3。 4 RT-qPCR 检测 4.1 反转录合成 cDNA 方法同附录 A 的 4.1。 4.2 qPCR 扩增 反应体系为 20 L，在 PCR 管中加入以下试剂： 上述合成的cDNA模板 0.8 L 2TransStartTMGreen qPCR SuperMix UDG 10 L 10 mol/L上游引物qZYMV F 0.4 L 10 mol/L下游引物qZYMV R 0.4 L ddH2O 8.4 L 反应步骤程序： 50 2 min a 预变性 95 10 min b 变性 95 10 s c 退火 65 30 s d 延伸 72 10 s 步骤 b-d 40 个循环。 湖南省标准信息公共服务平台DB43/T 13702017 7 5 结果记录 见图 B1 和表 B1。 图 B1 田间南瓜病叶的溶解曲线 表 B1 田间南瓜病叶的定量检测 6 结果判定 阳性对照的溶解曲线在相应位置出现特异性的波峰， 阴性对照只出现很小的波峰且在荧光阈值线以下，则检测结果有效。待测样品出现与阳性对照相似的特异性波峰判定为阳性；待测样品出现与阴性对照相似的波峰判定为阴性。 湖南省标准信息公共服务平台