T∕CVMA 14-2020 鸭坦布苏病毒抗体血凝抑制检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 142020 鸭坦布苏病毒抗体血凝抑制检测方法 Hemagglutination - inhibition detection method for antibody against duck Tembusu virus 2020-5-20 发布 2020-5-20 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 142020 目 次 前 言. I 引 言. II 1 范围. 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 缩略语. 1 5 试剂和材料 . 1 6 器材和设备 . 2 7 血清样本的处理 . 3 8 操作步骤 . 3 9 结果判定 . 5 附录 A（规范性）鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原的制备 . 6 附录 B（规范性）试剂配制 . 7 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件部分条款涉及专利的使用。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：北京市农林科学院、中国兽医药品监察所。 本文件主要起草人：林健、王小蕾、杨志远、杨承槐、段会娟、赵际成、刘立新、潘洁、程慧敏、侯力丹、刘月焕。 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 引 言 鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）引起的鸭生殖、免疫和神经等多系统脏器损伤的急性传染病。以产蛋鸭产蛋骤然大幅下降和雏鸭出现神经症状和死亡为主要特征，死亡率可达 20%。该病 2010 年起在福建、浙江、江苏、山东、河北和北京等蛋鸭养殖区流行，给鸭产业造成了巨大的经济损失。 鸭坦布苏病毒属于黄病毒属，目前国际上通用的黄病毒属血清学检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、琼脂扩散试验(AGP)、血凝抑制试验(HI)、补体结合试验(CFT)和中和试验(NT)等。其中，HI 方法具有敏感、简便的优点，在定性的同时也可以定量检测，并且不需要特殊仪器设备，更适合基层应用。 检测诊断是疫病防制的基础，研发准确、快捷的鸭坦布苏病毒病检测方法，对当前防控鸭坦布苏病毒病具有重要意义。北京市农林科学院通过暴露病毒粒子血凝特性工艺的研究，制备了鸭坦布苏病毒 HI 试验抗原，并建立了鸭坦布苏病毒抗体 HI 检测方法，该方法敏感、特异，易于操作，能快速定量检测鸭坦布苏病毒抗体水平。 制定该病的检测技术标准，将有助于保障养鸭业健康发展，预防该病的传播与危害，提高对该病的检测技术。 本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到 5.1、8 与抗原制备及检测操作方法相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何组织或者个人在实施本文件时实施专利。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得： 专利持有人：北京市农林科学院 联系人：刘月焕 地址：北京市海淀区曙光花园中路 9 号 北京市农林科学院 邮编：100097 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 1 鸭坦布苏病毒抗体血凝抑制检测方法 1 范围 本文件规定了鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）抗体血凝抑制检测方法的缩略语、试剂和材料、器材和设备、血清样本的处理、操作步骤、结果判定。 本文件适用于鸭和鹅等水禽鸭坦布苏病毒抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BABS：牛血清白蛋白硼酸氯化钠溶液（Bovine Serum Albumin Boric Acid Sodium Chloride Solution） DID50：鸭半数感染量（Duck Median Infective Dose） HA：血凝反应（Hemagglutination） HI：血凝抑制反应（Hemagglutination-Inhibition） HAU：血凝单位（Hemagglutination Unit） PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphate Buffered Saline） VAD：病毒调整稀释液（Virus Adjusting Diluent） 5 试剂和材料 5.1 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原 按照附录 A 制备。 5.2 标准阳性血清 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 2 鸭坦布苏病毒（HB 株）用无菌 0.5%乳汉液（按照附录 B.1 制备）稀释成 100 DID50 /0.5 mL，以 0.5 mL /只的剂量经肌肉注射途径接种 14 月龄未做任何疫苗免疫、无传染病史、无明显临床症状的健康鸭，感染后 14 d 采集血液分离血清制备而成，HI 试验检测鸭坦布苏病毒抗体效价1:80。 5.3 标准阴性血清 采集 14 月龄未做任何疫苗免疫、无传染病史、无明显临床症状的健康鸭血液，分离血清制备而成，HI 试验检测鸭坦布苏病毒抗体效价1:10。 5.4 鹅红细胞悬液 按照附录 B.2 制备。 5.5 0.33%工作浓度的鹅红细胞悬液 按照附录 B.3 制备。 5.6 10%工作浓度的鹅红细胞悬液 按照附录 B.4 制备。 5.7 阿氏液 按照附录 B.5 制备。 5.8 PBS（0.01 mol/L，pH 7.2） 按照附录 B.6 制备。 5.9 VAD： 按照附录 B.7 制备。 5.10 硼酸氯化钠溶液 按照附录 B.8 制备。 5.11 BABS 按照附录 B.9 制备。 5.12 25%白陶土悬浊液 按照附录 B.10 制备。 6 器材和设备 应配备如下器材和设备： 恒温培养箱：371； 冰箱：28； 低速离心机； 微量板振荡器； 单道和多道微量移液器及吸头：10 L100 L； 离心管：1.5 mL、15 mL； 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 3 96 孔 U 型微量板； 湿盒：商品化湿盒或自制，即塑料保鲜盒或铝制饭盒内置湿纱布。 7 血清样本的处理 7.1 血清样本的存放与运送 血清样本置-20以下冷冻保存，应避免反复冻融。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。 7.2 检测前血清样本的处理 7.2.1 100 L 血清加入 400 L25% 白陶土悬浊液。 7.2.2 剧烈震荡血清-白陶土混合物，每 5 min 震荡 1 次，共震荡 4 次。 7.2.3 室温下 1000 g 离心 20 min。 7.2.4 加入 100 L10%工作浓度的鹅红细胞悬液。 7.2.5 每 5 min 轻轻摇动上层清液，不得扰动下层白陶土沉淀，使红细胞保持悬浮状态，共摇动 4 次。 7.2.6 室温下 800 g 离心 10 min，红细胞沉积于白陶土上层。 7.2.7 将上清液移入新管中，此液体视为 1:5 稀释的待检血清。 8 操作步骤 8.1 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原 HA 效价测定 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验冻干抗原样品加入 1 mL BABS 复原，待抗原完全融化成澄清液体后，进行 HA 效价测定。采用 96 孔 U 型微量板进行试验，反应总体积为 100 L。从第 1 孔至第 12 孔，用移液器每孔加入 BABS 50 L，用移液器吸取被检样品 50 L，从第 1孔起，依次作 2 倍系列稀释，至第 11 孔，弃去移液器内 50 L 液体，第 12 孔为不加样的红细胞对照孔，然后每孔加入 50 L 0.33%的鹅红细胞悬液。立即在微量板振摇器上摇匀，放入湿盒，湿盒置 37作用 60 min，观察凝集反应。具体操作方法见表 1。结果判定方法：微量板水平放置，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 4 表 1 HA 效价测定操作术式 单位：L 孔数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 红细胞对照 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 稀 释 液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 抗 原 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 / 0.33%鹅红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 8.2 4HAU 工作抗原液的制备 根据测定的血凝抑制试验抗原的 HA 效价，用 BABS 配制 4 个血凝单位（4HAU）的抗原。血凝效价除以 8 为抗原的预稀释倍数。 示例：抗原的 HA 效价为 1:128，稀释倍数为 128/8=16，16 倍稀释，即 1 mL 的抗原液加入 15 mL BABS 进行稀释。 抗原配制完成应进行标定，即将 4HAU 抗原液做 HA 效价测定，稀释至 1HAU 时应使红细胞完全凝集，稀释至 0.5HAU 时应使部分红细胞凝集。 8.3 HI 试验 应用 96 孔 U 型微量板进行试验，反应总体积为 100 L。按表 2，用 BABS 将血清（待检血清处理方法见 7.2）作 2 倍系列稀释，加入 25 L 4HAU 工作抗原，充分振摇后，置于湿盒内 28过夜。取出恢复至室温后，加入 50 L 0.33%的鹅红细胞悬液，混匀，放入湿盒，湿盒置 37作用 60 min，观察凝集反应。试验应设阴、阳性血清对照、处理后的血清样品对照及红细胞对照。 表 2 HI 试验操作术式 单位：L 孔数 1 2 3 4 5 6 7 8 红细胞对照 血清对照 稀释倍数 5 10 20 40 80 160 320 640 稀释液 / 25 25 25 25 25 25 25 50 25 被检血清 50 25 25 25 25 25 25 25 / 25 4HAU 抗原 25 25 25 25 25 25 25 25 / / 0.33%鹅红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 8.4 HI 试验成立条件 微量板水平放置，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，阳性对照血清以凝集图形与红细胞对照孔一致（即红细胞呈显著钮扣状）的血清最高稀释度为判定终点，阴性对照血清孔红细胞应完全凝集。当对照阴、阳性血清的 HI 效价与已知效价相差不超过 1弃去 弃去 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 5 个滴度时，试验结果成立。 9 结果判定 微量板水平放置，以待检血清凝集图形与红细胞对照孔一致（即红细胞呈显著钮扣状）的血清最高稀释度作为判定终点；如果待检血清孔红细胞完全凝集，则判为 HI 效价 1:5。待检血清的 HI 抗体效价1:10 判为阴性，HI 抗体效价1:10 判为可疑，HI 抗体效价1:20 判为阳性。 库七七 w w w .k q q w .c o m 提供下载T/CVMA 142020 6 附录 A （规范性） 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原的制备 A.1 材料 A.1.1 鸭坦布苏病毒 （HB株） ： 分离自发病北京鸭的脏器组织，