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透性化酒精酵母细胞产海藻糖方法的研究.pdf

  • 上传人:first2
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  • 上传时间:2021-09-08
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    关 键  词:
    透性化 酒精 酵母 细胞 海藻 方法 研究
    资源描述:
    2 0 1 0N o 1 1 5 6 S e r i a lN o 2 2 4 C h i n aB r e w i n g R e s e a r c hR e p o r t 透性化酒精酵母细胞产海藻糖方法的研究 张建双,郭晓兵,于爽,姜鹏,郭继强 ( 大连工业大学生物工程学院,辽宁大连1 1 6 0 3 4 ) 摘要:研究了海藻糖牛物合成中酒精酵母细胞渗透处理工艺。试验结果表明,用1 5 m L 浓度为0 5 ( v v ) 的吐温6 0 为渗透剂,在3 0 条件下渗透处理l g 湿酵母4 5 m i n E P 得透性化酵母细胞,经发酵培养后海藻糖含量可达0 9 1 7 9 L 。 关键词:酒精酵母;透性化细胞;海藻糖 中图分类号:Q 9 3 3 3 5文献标识码:A文章编号:0 2 5 4 5 0 7 1 ( 2 0 10 ) 1 1 0 0 5 6 _ 0 3 P r o d u c t i o no f l r e h a l o s eb yy e a 哦u s i n gp e r m e a b i l i z a t i o nm e t h o d Z H A N G J i a n s h u a n g ,G U OX i a o b i n g ,Y US h u a n g ,J I A N GP e n g , G U OJ i q i a n g ( S c h o o lo f B i o l o g y E n g i n e e r i n g , D a l i a nP o l y t e c h n i q u e 咖诧强咄D a l i a n11 6 0 3 4 , C h i n a ) A h 啦国c t :T h ep r o d u c t i o no f t r e h a l o s eb yy e a s tu s i n gp e r m e a b i l i z a t i o nm e t I I o dw a si n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r T h ec e l l si ns u s p e n s i o nw e r ec o n v e r t e d i n t op e r m e a b i l i z e dc e l l sa l t e rl g w e t y e a s tc e l l s w e r e t r e a t e d b y1 5 m l0 5 ( v v ) T w e e n - 6 0 f o r 4 5 m i na t3 0 T h ec o n c e n t r a t i o no f t r e h a l o s ei nm e d i - 1 1 1 1 1W a SO 9 17 9 L K e yw o r d s :a l c o h o ly e a s t ;p e r m e a b i l i z e dc e l l ;t r e h a l o s e 海藻糖是一种稳定的非还原性双糖,在自然界中广泛 存在【l 】。特别是在酵母菌、霉菌等真菌中,海藻糖含量( 干 重) 1 6 以上 2 1 ,并且海藻糖水平取决于细胞所处的环境【3 】。 作为一种储存性碳水化合物,海藻糖在生物体内扮演极其 特殊的角色,能在干燥状态下保护生物体细胞内的蛋白质、 脂类、糖类、核酸等组分不受破坏【4 】。 生产海藻糖的方法较多 a - I ,其中酶法和基因法较为先 进,我国主要通过酵母法进行工业化生产。海藻糖合成酶 有多种,且均为胞内酶 6 1 ,其中酵母细胞海藻糖的合成是 从U D P 一葡萄糖和葡萄糖6 磷酸开始的。首先,两者合成海 藻糖6 一磷酸,接着海藻糖6 一磷酸酯酶去磷酸形成海藻糖 7 1 。 这2 个酶是由3 个肽链组成的复合体,分离纯化非常困难。 采用细胞透性化技术,一方面细胞可以在提高通透 性的同时保持整体结构完整,对胞内酶具有保护作用阎,便 于胞内酶的底物和产物的运输,从而提高胞内酶的生物 转化率;另一方面,采用物理或化学方法适度破壁,可以使 细胞内合成的目标产物释放到细胞外,从而减少由于产物 积累而造成的产物反馈抑制现象1 9 。根据使用的渗透剂或 方法的不同,细胞透性化技术【1 0 l 主要包括化学法、物理法 和生物法。本试验采用化学法,研究酒精酵母细胞渗透处 理方法,确立最佳工艺条件。 1 材料和方法 1 1 菌种 酒精酵母:大连工业大学生物工程学院微生物菌种保 藏中心。 1 2 培养基组成及试剂 1 2 1 培养基 种子培养基:葡萄糖2 ,蛋白胨2 ,酵母膏1 。 二级种子培养基:葡萄糖3 ,硫酸镁0 0 5 ,磷酸氢 二钾0 1 ,酵母膏l 。 发酵培养基:蔗糖3 ,硫酸镁0 0 5 ,磷酸氢二钾 0 1 ,氯化钠2 ,酵母膏l 。 1 2 2 试剂 葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、 四氯化碳、吐温6 0 、甲苯、无水乙醇、葸酮、浓硫酸等均为 分析纯。 1 3 主要仪器及设备 Y P 4 0 2 N 电子天平:上海精密科学仪器有限公司;Z H W Y 2 0 1 2 C 恒温培养振荡器:上海智城分析仪器制造有限 公司;恒温水浴锅:巩义市英峪予华仪器厂;W F J7 2 0 0 可 见分光光度计:尤尼柯( 上海) 仪器有限公司;S C 3 6 1 0 低 速离心机:科大创新股份有限公司( 中佳分公司) 等。 1 4 试验方法 1 4 1 培养条件 种子摇瓶:2 5 0 m L _ 三角瓶装液5 0 m L ,从斜面上取2 环菌 种,3 0 、1 6 0 r m i n 培养2 4 h 。 二级种子培养:2 5 0 m L Z 角瓶装液7 0 m L ,接种量7 , 3 0 0 C 、16 0 r m i n 培养2 9 h 。 发酵培养:2 5 0 m L 三_ 角瓶装液7 0 m L ,l g 透性化细胞, 3 0 0 C 、1 6 0 r m i n 培养3 6 h 。 1 4 2 酵母细胞渗透处理 将二级种子液于4 0 0 0 r m i n 离心l O m i n 收集菌体,所 收稿日期:2 0 1 0 - 0 7 1 5 基金项目:辽宁省教育厅资助项目( 2 0 2 0 7 0 1 ) 作者简介:张建双( 1 9 8 5 ) ,女,天津人,在读硕士研究生,研究方向为糖品物的开发及利用;郭继强,教授,通讯作者。 万方数据 研究报告 中国酿造 2 0 1 0 年第1 1 期 总第2 2 4 期 5 7 得菌体用5 0 m m o V L 、p H 值为7 0 的磷酸缓冲液洗涤,离心, 收集菌体。取1 9 湿酵母细胞悬浮在1 0 m L 透性化试剂中,于 3 0 振荡反应3 0 m i n ,离心,收集菌体。菌体再用上述缓冲 液重复洗涤2 次。离心,最终收集的菌体即为透性化细胞。 1 4 3 生物合成海藻糖 将上述透性化细胞加入发酵培养基中培养。 1 4 4 海藻糖含量的测定 用0 5 m o l L 三氯乙酸冰浴提取胞内海藻糖l h n 】,提取 2 次,提取液用蒽酮比色法测定海藻糖1 7 1 含量,并测出对应 的菌体生物量。每组实验平行3 次,结果取平均值。 2 结果与分析 2 1 最佳透性化试剂的选择 甲苯、四氯化碳为常用有机溶剂,吐温一6 0 为非离子表 面活性剂,其既可以对细胞进行自溶处理,又可以用于对 细胞进行透性化处理。此外,甲苯对酵母细胞进行渗透处 理时,加入低浓度的乙醇,可以提高渗透处理的效果,因此 实验也研究了2 种有机溶剂与其他试剂联合作用对酒精 酵母细胞进行渗透处理的效果。将酵母细胞用不同透性 化试剂按上述条件进行渗透处理,并与未经处理的酵母细 胞相对比,结果见表1 。 表1不同透性化试剂处理后海藻糖含量的测定 T a b l e1 T r e h a l o s ec o n t e n tp r o d u c e db yy e a s ta f t e rt r e a t e db yd i f f e r e n t p e r m e a b i l i t ys o l v e n t s 由表l 可见,各种透性化试剂对酵母细胞的通透性产 生不同程度的影响,其中吐温6 0 的效果最好,海藻糖含量 可达0 7 7 3 9 L :甲苯与乙醇、四氯化碳与E D T A 对菌体细胞 通透性的增加有协同增强作用;而其他3 种试剂对细胞破 坏作用较大,不仅海藻糖含量降低,而且菌体生物量也下 降。此外从吐温一6 0 本身毒害小、所用浓度低等方面综合考 虑,最终选定吐温6 0 为渗透剂进行下一步研究。 2 2 透性化试剂最适浓度的确定 选用不同浓度的吐温6 0 为透性化试剂,按上述方法 对酵母细胞进行渗透处理。测定发酵后海藻糖含量,结果 ( 图1 ) 可以看出,最初随着吐温一6 0 浓度的增加,海藻糖含 量不断提高并在浓度为O 5 时达到最高值0 7 7 1 9 L ,而后 继续增加吐温6 0 的浓度,海藻糖含量却开始降低,可见较 大浓度的吐温一6 0 对海藻糖的合成有不良影响。 2 3 透性化试剂最适用量的确定 ? 一 k V 赢 把 耱 艇 嫩 吐温一6 0 浓度, 图1 吐温6 0 浓度对海藻糖量的影响 F i g u r e1 E f f e c to fT w e e n - 6 0c o n c e n t r a t i o n sO ny i e l do ft r e h a l o s e 以浓度为0 5 ( v v ) 的吐温6 0 为渗透试剂,在湿酵母 细胞中分别加入5 m L 、1 0 m L 、1 5 m L 、2 0 m L 、2 5 m L 、3 0 m L 该 浓度的吐温6 0 ,按上述方法对酵母细胞进行渗透处理,测 定发酵后海藻糖含量,结果见图2 。 o V 删 把 露 铤 嫩 叶温一6 0 用晕m L 图2 吐温用量对海藻糖量的影响 F i g u r e2 E f f e c to fd i f f e r e n tv o l u m e s o fT w e e n - - 6 00 ny i e l do ft r e h a l o s e 由图2 可以看出,吐温6 0 用量为5 m I _ ,1 0 m L 时,海藻 糖含量增加较明显,当大于1 0 m L 后增加不再明显,而后用 量超过2 0 m L 时,海藻糖量开始降低。因此选择1 5 m L 为最 佳用量,此时海藻糖含量为0 9 1 9 L 。 2 4 透性化试剂最适作用时间的确定 , j V 咖 把 撩 挺 嫩 作用时问m i n 图3 作用时间对细胞产海藻糖量的影响 F i g u r e3 E f f e c to fd i f f e r e n tt i m e sO ny i e l do ft r e h a l o s e 用1 5 m L 浓度为0 5 的吐温6 0 为渗透试剂,分别对酵 母细胞进行1 5 r a i n 、3 0 r a i n 、4 5 r a i n 、6 0 r a i n 、9 0 r a i n 的渗透处 理,测定发酵后海藻糖含量,结果( 图3 ) 可知,渗透处理 万方数据 2 0 1 0N 0 1 1 5 8 S e r i a lN o 2 2 4 C h i n aB r e w i n g R e s e a r c hR e p o r t 3 0 r a i n 时最佳,此时海藻糖含量为0 9 0 8 9 L 。继续延长时间 效果反而不理想。 2 5 透性化试剂最适处理温度的确定 以1 5 m L 浓度为0 5 的吐温一6 0 为渗透试剂,分别在 2 4 、2 7 、3 0 、3 4 、3 7 条件下,对酵母细胞进行3 0 m i n 的渗透处理,测定发酵后海藻糖含量,结果见图4 。 ? 一
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