巨大芽孢杆菌产亚硝酸还原酶活性测定条件优化.pdf

研究报告 中国酿造 2 0 1 1 年第6 期 总第2 3 1 期2 7 巨大芽孢杆菌产亚硝酸还原酶活性测定条件优化 罗岩，孙君社，张京声，胡锦蓉，张莹，刘萍乖 ( 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京1 0 0 0 8 3 ) 摘要：为探明巨大芽胞杆菌产亚硝酸还原酶( n i t r i t er e d u c t a s e ，N i R ) 的催化特性，更好发挥其催化性能，该文从缓冲液种类、电子供 体种类及浓度、N a C I 浓度、加酶量以及反应温度和反应时间等几个方面研究了巨大芽胞杆菌产亚硝酸盐还原酶活性测定的适宜条 件。研究结果表明，该菌产N i R 酶活测定体系为：在2 5 0 此反应体系中加入N a 2 H P 0 4 ( 0 I m o l L ) 柠檬酸( O 0 5 t o o l L ) 缓冲液( p H 6 0 ) 1 2 5 斗L ；I m o l LN a C I1 5 皿：0 0 5 m o l L 甲基紫精( M v ) 7 5 ；曲、0 0 5 m o l L 硫代硫酸钠2 0 p L 和0 1 5 m o l L 连二亚硫酸钠2 0 9 L 作为电子供 体，加酶量5 0 1 L L ：优化后的反应条件为反应温度3 5 ，反应时间1 5 r a i n 。 关键词：巨大芽孢杆菌；亚硝酸还原酶；酶活测定 中图分类号：T S 2 0 1 3文献标识码：A文章编号：0 2 5 4 5 0 7 1 ( 2 0 1 1 ) 0 6 0 0 2 7 0 4 O p t i m i z a t i o no f d e t e r m i n a f i o nc o n d i t i o n so f n i t r i t er e d u c t a s ea c t i v i t yp r o d u c e db yB a c i l l u sm e g a t e r i u m L U O Y a h ，S U NJ u n s h e ，Z H A N GJ i n g s h e n g ，H UJ i m o n g , Z H A N GV i n g ，L I UP i n g + ( C o l l e g eo f F o o dS c i e n c ea n d N u t r i t i o n a lE n g i n e e r i n g , C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y , B e i j i n g1 0 0 0 8 3 , c h i n a ) A b s t r a c tI no r d e rt oi n v e s t i g a t ea n du t i l i z et h ec a t a l y t i cc h a r a c t e r i s t i c so f n i l f i t er e d u c t a s e ( N 哟p r o d u c e db yB a c i l l u sm e g a t e r i u m , t h ed e t e r m i n a t i o n c o n d i t i o n so f N i Ra c t i v i t yW e r eo p t i m i z e db yb u f f e r s ，e l e c t r o nd o n o r sa n dt h e i rc o n c e n t r a t i o n s ，N a C Ic o n c e n t r a t i o n ，e n z y m ed o s a g e ，r e a c t i o nt e m p e r a - t u r ca n dt i m e T h ed e t e r m i n a t i o ns y s t e m ( 2 5 0 乩L ) o f N i Ra c t i v i t yc o n s i s t e do f 0 I m o U LN a 2 H P 0 4 - 0 0 5 m o i Lc i t r i ca c i db u f f e r ( p H 6 o ) 1 2 5 止，I m o l L N a C I1 5 止，3e l e c t r o nd o n o r si n c l u d i n gO 0 5 m o l Lm e t h y lv i o l o g e n7 5 旺，O 0 5 m o l Ls d x i u mt h i o s u l f a t e2 0 止a n d0 1 5 m o l Ls o d i u md i t h i o n i t e 2 0 L ，a n dg l l z y n l e5 0 L T h er e a c t i o nw a sp e r f o r m e da t3 5 f o r1 5 m i n K e yw o r d s ：B a c i l l u sm e g a t e r u m ；n i t r i t er e d u c t a s e ；d e t e r m i n a t i o no f e n z y m ea c t i v i t y 腊肉、腊肠等腌制食品常使用亚硝酸盐作为发色剂， 因其兼具防腐、抑制肉毒梭状芽孢杆菌等，在腌制食品中 发挥着不可或缺的作用【l 】。然而亚硝酸盐在人体内残留是 十分有害的，可能产生高铁血红蛋白致使组织缺氧，或是 与蛋白分解生成的仲胺类反应生成强致癌物亚硝胺类物 质1 2 - 3 。亚硝酸盐对人类健康存在潜在威胁，但目前仍没有 一种产品能完全替代其在腌制食品中的应用【“4 1 。 降低腌制食品中亚硝酸盐含量的方法主要有化学方 法和生物方法。生物方法主要是利用微生物作为发酵剂 降低腌制食品中的p H 值或是产生的亚硝酸还原酶( n i t r i t er c d u c t a s e ，N i R ) 来降解腌制食品中的亚硝酸盐，使亚 硝酸盐的残留量控制在较低的水平。亚硝酸还原酶( N i r O 是催化亚硝酸盐还原为一氧化氮( N O ) 的酶啊。亚硝酸还 原酶分为血红素c d l 型亚硝酸还原酶和铜型亚硝酸还原酶 2 种类型【q ，为了确定亚硝酸还原酶的使用量，亚硝酸还原 酶活性的测定至关重要。目前亚硝酸还原酶活性测定主 要采用亚硝酸盐的比色测定。 本实验室前期筛选出一株降解亚硝酸盐的巨大芽孢 杆菌B m e g a t e r i u mM P F 9 0 6 ，并利用其产生的亚硝酸还原 酶来降低食品中亚硝酸盐含量。本实验主要研究亚硝酸 还原酶酶活测定体系中对亚硝酸还原酶酶活影响较大的 几个因素，确定了亚硝酸还原酶的最适反应体系以及反 应条件。该研究为亚硝酸还原酶的应用提供了理论依据， 为解决亚硝酸盐问题提供了一个新思路，既有理论意义， 又有现实指导价值。 1 材料与方法 1 1 菌种和发酵 L 1 1 菌种 巨大芽孢杆菌B m e g a t e r i u mM P F 9 0 6 ，由实验室分离 并保藏。 1 1 2 培养基 种子培养基：葡萄糖l S g L ，蛋白胨2 9 L ，K 2 H P 0 4 1 3 5 9 L ， K I - 1 2 P O , 0 7 0 9 L ，M g S 0 4 7 H 2 00 1 9 L ，N a C Il g L ，C a C h 2 H 2 0 0 0 2 9 L ，M n S O , H 2 00 0 1 9 L ，p H 7 0 。 发酵培养基：葡萄糖1 5 9 L ，牛肉膏2 9 L ，硫酸铵l g L ， K 2 H P 0 41 3 5 9 L ，K H 2 P O a0 7 9 L ，N a C Il g L ，M g S 0 4 7 1 - 1 2 0 0 4 9 L ，C a C h 2 H 2 00 0 2 9 L ，M n S 0 4 。H 2 00 0 1 9 L ，N a N 0 2 O 1 3 8 9 L ，p H 6 5 。 1 1 - 3 培养方法 种子培养：2 5 0 m L 三角瓶中的1 0 0 m L 种子培养基接种 斜面种子一环后，于3 0 0 C 、1 6 0 r m i n 振荡培养2 0 h - 2 4 h 。 发酵培养：按4 ( v v ) 的接种量接入2 5 0 m L _ = 角瓶中 的1 0 0 m L 发酵培养基中，于3 0 。C 、1 6 0 r m i n 振荡培养2 0 h 2 4 h 。待发酵结束后，于4 。C 、8 0 0 0 r m i n 离，I 1 0 m i n 收集菌体。 收稿日期：2 0 11 - 0 2 2 6 基金项目：国家自然科学基金项目( 2 0 8 7 6 1 6 4 ) ：国家8 6 3 计划课题( 2 0 0 8 A A l 0 2 3 0 6 ) 作者简介：罗岩( 1 9 8 5 ) ，女，河北张家口人，在读硕士研究生，研究方向为食品生物技术；刘萍，副教授，通讯作者。 万方数据 2 8 S e r i a lN 0 2 3 1 C h i n aB r e w i n g R c s e a r c hR e p o r t t 2 仪器与试荆 T G C 1 6 C 型高速冷冻离心机( 上海精密科学仪器厂) ， J Y 9 2 一I I 型超声波细胞粉碎机( 宁波新芝科嚣研究所) ， T U ，1 9 0 1 型双光束紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪 器厂) ：甲基紫精( M v ) ，S i g m a 公司产品。 13 试验方法 亚硝酸还原酶粗酶液的制各：按文献 7 方法进行。 亚硝酸盐还原酶括力测定；测定酶话匣应体系共 2 5 0 J L l 目：0 l m o l L 磷酸盐缓冲液( p H65 ) 1 2 5 v L ，0 l m o I L N a C l l 5 “L 0 l m o l J L N O i l 25 0 , 1 0 1 m o l F L 甲基紫晶( M V ) 7 5 止，OI m o U L N a 母z O , 4 0 “L 酶液5 0 也。3 0 水浴中反应 1 0 m i a ，剧烈振荡终止反应。用蒸馏水补足到l m L ，吸取 2 0 0 血加入2 5 m L 容量瓶中，按照格利斯试剂比色法”测定 亚硝酸盐的变化。酶活定义为每分钟所还原l n m o l 亚硝酸 盐所需要的酶量定义为一个酶活力单位，U m L 。 2 结果与分析 21 酶活测定反应体系的建立 在酶活原测定体系基础上，分别改变不同的影响因 素( 缓冲液种类、电子供体种类和浓度、氯化钠浓度、加酶 量、反应时间) 作亚硝酸还原酶活性的测定，从而确定酶恬 测定条件。 2 11N i R 适宜缓冲藏种类的确定 分别以0l m o l F L 磷酸缓冲液、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲 液、柠檬酸钠柠檬酸缓冲液( p H5 , 8 、6 0 、6 2 、6 4 、66 、6 8 、 70 ) 作为缓冲液，其他条件不变，测定N i P 活性，结果( 图1 ) 表明当p H 从58 增大到6 4 时选用磷酸氢二钠一柠檬酸缓 冲液时所测的酶活力先升高后降低，并且高于另外2 种缓 冲液的酶活力，当讲值从6 4 增大为70 时，所测的酶活力 均呈现继续降低趋势，因而选取磷酸氧二钠一柠檬酸缓冲 液作为反应缓冲液，并且当p H 值为60 时酶活力取得最大 值，此时酶活力为2 0 97 8U m L 。 目 采 蟮 船 N I - I P O 拧檬酸 柠橡酸带嫌酸铺 N m I - L P O , - N a H 2 P q 州口 田1 不目缓冲灌对亚硝酸还原赫力的骺响 F i g u m lE f f e c t “d W e r e n t