酒精酵母的复合诱变与甜高梁秆汁培养基的优化.pdf

研究报告 中国酿造 2 0 1 1 年第4 期 总第2 2 9 期 酒精酵母的复合诱变与甜高粱秆汁培养基的优化 周广麒，张学良，王培忠 ( 大连工业大学生物工程学院，辽宁大连1 1 6 0 3 4 ) 摘要：以甜高粱秆汁为基本原料，采用U V 和D E S 复合诱变后获得酵母菌株F U D - 3 ，再通过响应面法优化培养基中的营养因子C O ( N H ：) ：、M g S O 。、K H ：P O 。、C a C l ：和F c C l ，提高了酒精的得率。结果表明：用驯化的方法使酒精酵母耐糖能力提高，通过u V 与D E S 复合诱变 的方式进行酵母的选育，以提高其产率。采取响应面法对发酵培养基进行优化，得到各因素的最佳质量浓度C O ( N H ：) ：、M g S O , 、K H ：P 0 4 、 C a C l 2 和F e C l 3 的添加量分别为4 8 3 1 8 9 L 、1 3 7 3 4 9 L 、4 8 1 1 4 9 L 、5 8 5 7 1 9 L 0 6 9 6 2 9 L 。训育后的酵母F - 1 与经过复合诱变优化后的酵母 F U D 3 发酵相比：残糖由2 6 4 1 L 减到9 2 4 l s L 、酒精产率由8 0 2 8 提高为9 3 4 6 ，酒精的产量7 9 2 9 9 L 增加为1 0 0 4 4 s L ，提高了2 6 6 7 。 关键词：甜高粱汁；复合诱变；营养因子；响应面法；酒精 中图分类号：Q 9 3 3 5 5文献标识码：A文章编号：0 5 2 4 5 0 7 1 ( 2 0 1 1 ) 0 4 0 0 7 7 0 4 C o m p l e xm u t a g e n e s i so fa l c o h o ly e a s ta n dm e d i u mo p t i m i z a t i o no fs w e e ts o r g h u ms t a l kj u i c e Z H O UC u a l l g q i ，Z H A N GX u e l i a n g ，W A N GP e i z h o n g ( S c h o o lo f B i o l o g i c a l F o o dE n g i n e e r i n g ，D a l i a nP o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y ，D a l i a n1 1 6 0 3 4 ，C h i o 也) A b s t r a c t ：U s i n gt h es w e e ts o r g h u ms t a l kj u i c e b a s i c m a t e r i a l s ，F U D - 3y e a s ts t r a i nw a so b t a i n e db yU Va n dD E Sc o m p l e xm u t a g e n e s i s T h em e d i u m n u t r i t i o n a lf a c t o r ss u c ha sC O ( N H 2 ) 2 ，M g S 0 4 ，K H 2 P 0 4 ，C a C l 2a n dF e C l 3w e r eo p t i m i z e dw i t l Ir e s p o n s es u r f a c em e t h o d T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e s i s t - a n c es u g a rc a p a b i l i t yo fa l c o h o ly e a s tW a si m p r o v e d T h eo p t i m u mm e d i u mw a f t f o l l o w s _ , C O ( N H 2 ) 2 4 8 3 1 8g L ，M g S 0 4I 3 7 3 4g L ，K H 2 P O , 4 8 1 1 4 g L ，C a C l 25 8 5 7 1g La n dF e C l 30 6 9 6 2g L W h e nc o m p a r i n gy e a s tF U D - 3o b t a i n e df r o mc o m p l e xm u t a g e n e s i sw i t l la c c l i m a t e dy e a s tF - 1 ，c o n t e n to fr e - s i d u a ls u g a rd e c r e a s e df r o m2 6 4 1s Lt o9 2 4s L ，a l c o h o ly i e l di n c r e a s e df r o m 踟2 8 t o9 3 4 6 ，a n da l c o h o lp r o d u c t i o nw f r o m7 9 2 9g Lt o1 0 0 4 4g L ，w h i c hi n c r e a s e db y2 6 6 7 K e yw o r d s ：s w e e ts o r g h u ms t a l kj u i c e ；c o m p l e xm u t n g e n e s i s ；n u t r i t i o n a lf a c t o r ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d ；a l c o h o l 当前，随着环境的不断恶化，粮食的紧缺，化石能源面临 的枯竭，而生物能源以其可再生性引起世界各国科学家的关 注。燃料酒精以其独有的性质成为化石能源的理想替代品， 以生物发酵法最为经济环保。在众多的原料中，c 。植物甜高 粱以其适应性强、抗逆性好、光合速率高、生长速度快、糖分积 累快、生物质产量高等优点，可以利用我国的边界性土地，实 现了不与人争粮、不与粮争地的问题。甜高粱汁液体发酵是 研究的重点，目前市场上没有很好的菌株方便于液体发酵和 连续化生产，因此筛选出耐酒精、耐高糖、具有凝集型的便于 连续化生产的发酵菌株是当前研究的热点。 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 甜高粱 “九甜粱1 号”，大连工业大学甜高粱试验田。 1 1 2 菌种 S a c c h a r m y c e s F F C C 2 1 6 7 ，大连工业大学食品发酵微生 物菌培养与保藏中心。 1 1 3 种子培养基 葡萄糖2 2 ，酵母膏0 8 5 ，蛋白胨2 ，p H5 0 ， 1 1 5 灭菌3 0m i n 。 1 1 4 发酵培养基 甜高梁茎秆榨出汁，p H 5 0 ，1 1 5o C 灭菌3 0 r a i n 。根据试 验的方案确定C O ( N H ：2 、M g S 0 4 、K H 2 P 0 4 、C a C l ：和F e C l 3 的 添加量。 1 2 试验方法 1 2 1 甜高粱汁的制备 去掉叶、穗，茎秆经粉碎后榨汁、过滤，煮沸l O m i n ，贮 存于4 。C 冷藏箱内，备用。 1 2 2 出发菌株的获得 将甜高粱汁制成1 9 。B x 培养基中连续培养3 代，将酒 精产量最多的菌种在2 2 0 B x 的培养基中连续培养3 代，最 后在2 5 0 B x 的培养基中培养3 代，获得稳定酵母，驯化后获 收稿日期：2 0 1 0 1 2 1 6 基金项目：辽宁省教育厅A 类项目资助( 2 0 0 8 0 7 0 ) 作者简介：周广麒( 1 9 5 7 一) ，男，辽宁大连人，副教授，研究方向为微生物技术与产业化研究。 S S C P 解析 J 微生物学通报，2 0 0 9 ，3 6 ( 9 ) ：1 3 6 3 1 3 6 7 1 0 吴谋成等食品分析与感官评定 M 北京：中国农业出版社，2 0 0 2 1 1 E R I CS ，P A U L AL ，B O E Tc ，e ta 1 A n a l y s i so ff u n s a Id i v e r s i t yi nt h e w h e a tr h i z o s p h e r eb ys e q u e n c i n go fc l o n e dP C R a m p l i f i e dg e n e se n c o d i n g 1 8 Sr R N Aa n dt e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s J A p p lE n v i r o l lM i c r o b ，1 9 9 9 ，6 5 ( 6 ) ：2 6 1 4 - 2 6 2 1 1 2 赵春青，李多川嗜热子囊菌两个中国新记录种 J 茵物研究， 2 0 0 5 ，3 ( I ) ：2 7 - 2 9 万方数据 7 8 s 黧三徽2 9 C h i n aB r e w i n g R e s e a r c hR e p o r t 得诱变的出发酵母菌株F F C C - 2 1 6 7 - 1 ( 简写F 一1 ) 。 1 2 3 紫外( u v ) 诱交 培养F 一1 到对数生长期，制成菌悬液，经磁力搅拌器于 紫外灯下( 1 5 W ，3 0 c m ) 分别照射0 s 1 2 0 s ，每次间隔l O s ， 3 2 。C 暗培养4 8 h ；同时取一份样品不经u V 照射。用菌落计 数法计算不同照射时间的致死率，以致死率7 5 一8 0 的 照射时间作为诱变时间，筛选出酵母F U l 。 1 2 4 硫酸二乙酯( D E S ) 诱变 将F U 1 制成菌悬液，取菌悬液2 0 m L ，加入不同体积 D E S 置于3 2 。C 水浴中振荡后，立即加入加2 0 m L 硫代硫酸 钠溶液中和反应 ，由D E S 诱变后得到菌株F U D 一1 。 1 2 5 测定方法 糖的测定：D N S 比色法口】，p H 值的测定：使用P H S - 2 5 数显p H 计检测，酒精浓度的测定： 蒸馏法1 ，校正为2 0 时的酒精度。 2 结果与讨论 2 1 训育后的酵母菌株F 1 的发酵试验 表1 菌株F 1 的发酵试验结果 T a b I e 1 R e s u R so fv e n f i c a t i o ne x p e r i m e n t 由表1 可知，残糖为施4 1 9 L ，酒精产量7 9 2 6 9 L ，得 率为8 0 2 8 。 2 2U v 照射时间下的致死率 由图1 可知，随着u V 照射时间的增加，酵母菌的死亡 率也逐渐升高。试验选取致死率为7 5 一8 0 的u V 照射 时间( 即7 5s ) 作为诱变处理的时间。 1 0 0 8 0 誊6 0 献 1 毓4 0 2 0 05 0 1 0 0 1 5 0 ， 时间s 闺1 不同U V 照射时间酵母致死率的变化 F i g u r e1 T h em o r l e yo fy e a s tu n d e rt h ed i f f e r e n ti r r a d i a t i o nt i m eo fU V 2 3 同一浓度D E S 不同作用时间下的致死率 由于u V 诱变后得到的菌株不太理想，为了获得酒精 产量更高的菌株，所以进行D E S 诱变。 1 0 0 8 0 蔷6 0 献 箭4 0 2 0 0 24 6 81 01 2 时间m i n 图2 同一浓度D E S 不同作用时间下的酵母致死率 F i g u r e2 T h em o r t a l i t yo fy e a s tu n d e rt h ed i f f e r e n tr e a c t i o