Cry2A杀虫蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化.pdf

万方数据 上海农业学报 因连接到p E T 3 0 a ( + ) 载体上，通过优化表达条件让其在大肠杆菌中实现高效表达，并采用N i - N T A 亲 和柱来分离纯化目的蛋白，为以后抗体的制备、进一步开展水稻外源蛋白C r y 2 A 的安全性研究以及检测 研究奠定了基础。 1 材料与方法 1 1 菌株与质粒 大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) 、D H 5 a 和原核表达载体p E T 3 0 a ( + ) 由本实验室保存；含C r y 2 A 基因的质粒 p C A M B I A1 3 0 0 C r y 2 A 由上海市农业生物基因中心提供。 1 2 酶及试剂 限制性内切酶E c o R I 和砌m H I ，E x n qD N A 聚合酶以及D N AM a r k e r 购自T a k a r a 公司；T 4 D N A 连接酶购自F e r m e n t a s 公司；质粒提取试剂盒以及D N A 回收试剂盒为本实验室自主研制；其他试 剂均购自国药集团化学试剂有限公司。 1 3c r j ，2 A 基因表达载体构建 根据水稻密码子优化的c r y 2 A 基因序列，同时考虑了p E T 3 0 a ( + ) 载体上多克隆位点、阅读框以及 T 7 启动子的作用方向设计引物，上游引物为：5 一C G G G A T C C A T G G A G G A G A A C A A T C A G A A C - C A G T G 3 ，下划线部分为励m H I 酶切位点；下游引物为：5 - C G G A A T T C C T A C T T T T G T - G C T C T T T C A A G G T C A G 3 ，下划线部分为E c o R I 酶切位点。 以含有c r y 2 A 基因的p C A M B I A1 3 0 0 质粒为模板进行P C R 扩增，P C R 产物和表达载体p E T 3 0 a ( + ) 均用砌m H I 和E c o R I 切成双粘性末端，T 4D N A 连接酶连接，转化E c D f jD H 50 c 感受态细胞。通过卡 那霉素抗性筛选，挑取单菌落进行P C R 鉴定。提取转化株质粒经砌m H I 和D R I 酶切鉴定及测序鉴 定后，转人大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) 表达c r y 2 A 蛋白。方法均参照s a m b r o o k 的分子克隆( 第二版) 3 进 行。 1 4 表达重组蛋白 将测序正确的重组子接种于5m LL B 培养基( 含卡那霉素5 0 肛g m L ) 中，3 7 摇床培养至对数生长 前期( O D 。约为o 6 ) ，加人I P T G 诱导3 4h 。取培养好的菌液1m L ，以1 0o o or m i n 室温离心2m i n 集菌，弃上清，2 0 0 肛L 纯水悬起沉淀，取2 0 弘L 悬浮液加入2 0 弘L2 S D S 凝胶加样缓冲液，煮沸1 0m i n ， 取2 0u L 进行S D S P A G E 分析。凝胶染色3 0m i n ，脱色完全后进行分析。 1 4 1 I P T G 浓度对蛋白表达的影响取重组子甘油菌5 0 肚L 加入到5m LL B 液体培养基( 含卡那青 霉素5 0 弘g m L ) 中，3 7 、2 2 0r m i n 过夜培养，再按1 ：1 0 0 的接种量转接到装有5m LL B 液体培养基 ( 含卡那青霉素5 0 弘g m L ) 的试管中，3 7 、2 2 0r m i n 培养3h ( O D 。约为o 6 ) 。分别在试管中加入不 同量的I P T G ，使I P T G 的终浓度分别为o 、o 0 1 、o 0 5 、o 1 、o 2 、o 4 、o 5 、o 6 、o 8 、1 o 、1 5m m o l L ， 3 0 诱导6h ，取1m L 菌液离心集菌后进行S D S P A G E 分析表达情况。 1 4 2 诱导时间对蛋白表达的影响取重组子甘油菌5 0 肚L 加入到5m LL B 液体培养基( 含卡那青霉 素5 0 肛g m L ) 中，3 7 、2 2 0r m i n 过夜培养，再按1 ：1 0 0 的接种量转接到装有5m LL B 液体培养基( 含 卡那青霉素5 ( ) 弘g m L ) 的试管中，3 7 、2 2 0r m i n 培养，使O D 。达到0 6 左右。分别在试管中加入 I P T G 终浓度为o 4m m o l L ，3 0 诱导1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8h 后分别取出试管，取1m L 菌液离心集菌后 进行S D S P A G E 分析表达情况。 1 4 3 诱导温度对蛋白表达的影响取重组子甘油菌5 0 扯L 加入到5m LL B 液体培养基( 含卡那青霉 素5 0 肛g m L ) 中，3 7 、2 2 0r m i n 过夜培养，再按1 ：1 0 0 的接种量转接到装有5m LL B 液体培养基( 含 卡那青霉素5 0 肛g m L ) 的试管中，2 2 0r m i n 、3 7 摇床中培养，使O D 。达到0 6 左右。分别在试管中加 入I P T G 终浓度为o 4m m o l L ，置于1 6 、2 5 、3 0 、3 7 不同摇床中诱导，取1m L 菌液离心集菌后进行 S D S P A G E 分析表达情况。 1 5 包涵体的制备 甘油菌过夜培养后，接种1 0m L 于1LL B 中，3 7 培养至O D 。达到0 6 ，加入I P T G 至终浓度为 ( ) 4m m o l L ，3 0 继续培养6h 。收集菌体，以2 0m L 超声缓冲液( 2 0m m o l LT r i s H c l ，3 0 0m m o l L N a C l ，1 0m m o l L 咪唑，p H8 0 ) 重悬细胞，冰浴超声波破碎，功率3 0 0w ，每次2 0s ，问隔2m i n ，共5 次。 4 、1 20 0 0r m i n 离心2 5m i n 沉淀包涵体，弃上清液。加入3 0m L 洗涤液( 5 0m m o l LT r i s H C l 、 3 0 0m m o l LN a C l ，2m o l L 尿素、0 5 T r i t o n 1 0 0 ，p H8 o ) 超声波破碎，功率3 0 0w ，每次5s ，间隔 万方数据 万方数据 上海农业学报 1 3 9 72 k D 6 64 k D M 7891 M ：低分子量标准蛋白；1 3 ：B L 2 1 ( D E 3 ) 空宿主菌、B L 2 1 ( D E 3 ) - p E T 3 0 a ( + ) 空载表达菌、c r y 2 A 重组菌诱导前总蛋白； 4 1 4 ：I P T G 浓度分别为u 、( ) 0 1 、( ) 0 5 、o 1 、( 】2 、o 4 、( ) 5 、o 6 、O 8 、1 o 、1 5m m o l L 的重组表达菌B L 2 1 ( D E 3 ) - p E T 3 0 a ( + ) c r y 2 A 诱导表达菌体总蛋白 圈3I P T G 对c r y 2 A 重组蛋白表达影响的s D s _ P A G E 分析 F i 玉3S D s P A G Ea n a l y s i so fr e c o m b i n a n tC r y 2 Ap r o t e i n se x p r e s s i o na si n n u e n c e db yI P T G 2 2 2诱导时间对蛋白表达量的影响 从图4 可以看出，目的蛋白的诱导表达量随着诱导时间的增加 而增加，当诱导时间达到6h 后目的蛋白表达量趋于稳定。 9 72 k D 6 64 k D M ：低分子量标准蛋白；1 2 ：空宿主菌B L 2 1 诱导前、后菌体总蛋白；3 4 ：空载体表达菌B L 2 1 - p E l 3 ( ) a ( + ) 诱导前、后菌体总 蛋白；5 1 3 ：诱导时间分别为0 、1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8h 时重组表达菌B L 2 1 ( D E 3 ) p E T 3 ( ) a ( + ) c r y 2 A 诱导表达菌体总蛋白 图4 诱导时间对c r y 2 A 重组蛋白表达影响的s D s P A G E 分析 F i g 4S D s _ P A G Ea 曲l y s i so fr e c o m b i n a n tC r y 2 Ap r o t e i n se x p r e s s i o na si n n u e n c e db yt i m e 2 2 3 诱导温度对蛋白表达量的影响当诱导温度为1 6 和2 5 时，菌体总蛋白表达量较少，目的蛋 白表达量也较少；诱导温度为3 0 时，目的蛋白表达量最多，以包涵体的形式表达。从蛋白表达的总量 上看，诱导温度为3 7 时，菌体蛋白表达的总蛋白量较高，但目的蛋白较少( 图5 ) 。 M ：低分子量标准蛋白；1 ：B L 2 1 ( D E 3 ) - p E T 3 0 a ( + ) 诱导后包 涵体总蛋白；2 5 ：诱导温度分别为1 6 、2 5 、3 ( ) 、3 7 条件重组 表达菌B L 2 1 ( D E 3 ) p E T 3 0 a ( + ) c r y 2 A 诱导表达菌体总 蛋白 图5诱导温度对。啦A 重组蛋白表达影响的s D s - P A G E 分析 F i g 5 S D s - P A G Ea n a I y s i so fr e c o m b i n a n tC r y 2 Ap r o t e i n s e x p r e s s i o na si n n u e n c e db yt e m p e r a t u r e 2 3 表达蛋白的纯化和复性 6 4 k D M ：低分子量标准蛋白；1 ：空载表达菌B L 2 1 p E T 3 0 a ( + ) 菌体总蛋 白；2 3 ：重组表达菌B L 2 1 p E T 3 0 a ( + ) c r y 2 A 诱导前、诱导后菌 体总蛋白；4 5 ：包涵体沉淀、上清总蛋白；6 ：包涵体沉淀裂解后总 蛋白；7 ：N i - N T A 柱纯化后C r y 2 A 蛋白；8 ：复性后C r y 2 A 蛋白 图6C r y 2 A 包涵体蛋白纯化复性s D s _ P A G E 电泳图 F i g 6 S D s - P A G Ep a t t e mo fo c c l u d e dC r y 2 Ap m t e i n s v j ap u r i f i c a t i O na n dr e n a t u r a t i o n 将I P T G 终浓度为o 4m m o l L 、3 0 诱导6h 的菌体用超声波破碎后制备包涵体。将包涵体过N i N T A 层析柱纯化，再将纯化后的蛋白复性。分别取包涵体蛋白和复性后蛋白样品进行s D s P A G E 电泳， 结果如图6 所示。经软件分析得出：C r y 2 A 蛋白条带的灰度占包涵体总蛋白灰度的5 1 3 ；纯化后蛋白 纯度可达9 1 5 ；透析后蛋白纯度没有太大变化，为9 0 8 。 2 4 二化螟活性试验 由表1 可见，复性后的蛋白表现出杀虫活性。用S P S S 软件计算杀虫活力，其L D ；。值为5 3 2 肛g g ， 9 5 置信区间为3 3 2 8 5 3 肛g 旭。 表lc r y 2 A 蛋白二化螟杀虫活性 T a b l elI n s e c t i c i d a la c t i V i t yo fC I y 2 Ap r o t e i no nC h f f os H p p r P s s n f f s 万方数据 1 4 杨奇